Vodniki so odšli domov, luči so pogašene, šolarčki pa že mižijo v svojih posteljah … vendar za starimi muzejskimi zidovi še ni miru. Nekdanji nočni čuvaj Larry Daley (Ben Stiller) se spet znajde v pustolovščini z oživljeno zgodovino – še večji in še bolj nori kot kdaj prej! V drugem delu "Noči v muzeju" ga tako čaka bitka, ki je tako epska, da se lahko odvije samo na hodnikih največjega muzeja na svetu.

Larry mora namreč rešiti svoje nekdaj negibne prijatelje, ki se bojujejo sredi smithsonijskih čudes; vsako od njih, od slavnih slik na stenah do vesoljskih ladij v dvoranah, zdaj deluje po svoje. Zgodba se začne, ko Larry pusti delo čuvaja in postane uspešen izumitelj izdelkov Daley Devices, ki jih prodaja po televiziji. Zdi se, da ima vse, a mu nekaj vendarle manjka.

Zato se vrne v Naravoslovni muzej, kjer je nekoč doživel najbolj čarobno noč svojega življenja. Toda tam ga pričaka grozno odkritje – njegove najljubše eksponate, nekateri od njih so celo njegovi najboljši prijatelji, so zaradi zastarelosti odstranili in jih v skrinjah poslali v ogromni muzej Smithsonian v Washingtonu.

Usoda eksponatov je negotova, dokler Larryja ne pokliče miniaturni kavboj Jedediaha (Owen Wilson), ki ga opozori na prihajajočo katastrofo. Prišleki so namreč zbudili svoje nove "sostanovalce", vključno z egipčanskim vladarjem Kahmunrahom (Hank Azaria), ki je po 3000 letih ležanja še posebej tečen.

Skupaj s še tremi zgodovinskimi "podleži" – Ivanom Groznim (Christopher Guest), Napoleonom Bonapartom (Alain Chabat) in Alom Caponejem – je skoval načrt za zavzetje muzeja, nato pa še sveta, in v ta namen zbral vojsko iz podzemlja. Larry odhiti v ameriško prestolnico, čeprav se ne zaveda, v kaj se spušča. Vendar dobi nekaj novih prijateljev – od izjemnega Alberta Einsteina do iskrenega Abrahama Lincolna, in spozna celo eksponat, ki mu spodnese tla pod nogami – neukrotljivo Amelie Earhart (Amy Adams).

Slednja Larryja spodbudi, da znova najde svoj smisel za zabavo in pustolovščino. S starimi pajdaši, kot so Teddy Roosevelt (Robin Williams), cesar Avgust (Steve Coogan), indijanka Sacajawea (Mizuo Peck), Hun Atila (Patrick Gallagher) in neandertalci, Larry napne vse sile, da reši stare prijatelje in washingtonskemu National Mallu še pred zoro povrne red.